玉研香煙染毒系統 | 自動、靈活、安全建立香煙暴露小鼠模型——助力慢阻肺的病理研究

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進一步發展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病。其致殘率和病死率居高不下，全球40歲以上人群中的發病率已高達9%～10%，嚴重危害著人們的健康。

慢阻肺以持續氣流受限為特征，這種氣流受限呈進行性發展，與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關。氣流受限和氣道阻塞作為該疾病最重要的病理生理改變，其確切病因尚不完全明了，但普遍認為是由個體易患因素和環境因素共同作用的結果。許多患者還常常伴隨其他有臨床癥狀的慢性病，這無疑增加了慢阻肺的發病率和病死率。

在探討慢阻肺的病因時，我們不得不提的是吸煙這一最常見和最主要的危險因素。長期吸煙不僅直接損害呼吸道，還可能導致職業性粉塵和化學氣體等其他有害物質的吸入風險增加，從而加劇慢阻肺的發生。香煙中的有害物質通過誘導氣道上皮炎癥反應，破壞上皮屏障，促進免疫細胞的聚集，并導致粘液分泌過多和小氣道壁的重塑。

近期，復旦大學上海醫學院附屬中山醫院肺病危重癥醫學科張靜教授團隊在國際權威期刊上Free Radical Biology and Medicine發表一篇題為“ROS induced the Rab26 promoter hypermethylation to promote cigarette smoking-induced airway epithelial inflammation of COPD through activation of MAPK signaling”的文章。他們發現，香煙暴露會導致肺組織的表觀遺傳改變，這種改變與慢阻肺的慢性炎癥緊密相關。其中，DNA甲基化作為控制表觀遺傳轉錄的主要方式，在吸煙影響下的變化尤為關鍵。吸煙通過調節DNA甲基轉移酶的表達，進而影響到慢阻肺的發病過程。

此外，研究還揭示了香煙暴露下氣道炎癥反應的更深層次機制。香煙產生的活性氧（ROS）在這一過程中扮演著重要角色。ROS不僅調節DNMTs的表達，還影響到p53和Bcl2的功能，最終導致氣道上皮細胞的凋亡。盡管ROS在調控基因甲基化/去甲基化過程中的具體機制尚不完全清楚，但這一發現無疑為我們理解慢阻肺的發病機制提供了新的視角。

值得一提的是，Rab蛋白作為調節細胞功能的重要分子，在肺部炎癥中也發揮著不可忽視的作用。特別是Rab26，它被發現能夠抑制炎癥信號，減弱肺內皮細胞的炎癥反應。然而，在香煙暴露后，Rab26的作用機制及其與氣道炎癥的關系仍待進一步揭示。

這項研究不僅深化了我們對慢阻肺發病機制的理解，也為未來的治療提供了新的思路。通過深入研究ROS和Rab26等分子在氣道炎癥反應中的作用，我們有望開發出更為有效的預防和治療策略，為慢阻肺患者帶來福音。

文中提到，在卷煙暴露條件下，ROS通過促進DNMT3b介導的Rab26啟動子DNA甲基化來抑制Rab26的表達，下調Rab26的表達可增強p38和JNK MAPK信號的激活，導致炎癥細胞因子的過量產生；NAC（N-乙酰半胱胺酸）恢復Rab26也可減輕香煙暴露誘導的氣道上皮炎癥反應

研究者首先建立了香煙暴露小鼠模型，使用全身香煙煙霧暴露系統，將小鼠（n = 5）暴露于20支香煙中，每天兩次，每周6天，持續2小時，持續三個月。對照組（n = 5）保持在相同的環境中，包括相同的食物量，不接觸香煙。全身香煙煙霧暴露系統由上海玉研儀器提供，配備全自動香煙煙霧發生器、暴露箱體和層流生物安全柜。為避免操研究者接觸二手煙，暴露箱體設置在層流生物安全柜內，香煙由自動香煙煙霧發生器產生，并被泵入暴露箱。隨后采集小鼠肺和支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行H&E染色、免疫組化（IHC）和炎癥介質測定。同時測定小鼠的體重、白細胞計數、Hct和HbCO水平。

香煙暴露誘導氣道上皮炎癥反應

香煙暴露染毒的氣道炎癥反應是COPD的一個主要特征。在此，研究者評估了體內和體外香煙暴露氣道上皮的炎癥反應。H&E染色顯示，香煙暴露小鼠氣道上皮結構被破壞，支氣管周圍出現大量中性粒細胞（圖.1A）。此外，肺泡空間擴大和破壞（圖.1A）。病理改變與吸煙相關的COPD和肺氣腫一致。全身香煙暴露小鼠的全身性炎癥水平也被評估。與對照組相比，全身暴露小鼠的BALF IL-8和IL-6水平顯著升高（圖.1B＆C）。

圖1.香煙暴露誘導體內和體外炎癥反應

香煙暴露抑制了Rab26在氣道上皮中的表達

數據顯示，在COPD患者的樣本中，肺組織中Rab26水平的PKM明顯低于非COPD患者（圖.2A）.IHC數據顯示，香煙暴露的小鼠的肺氣道上皮細胞中Rab26的表達低于對照組小鼠（圖.2B）.此外，與對照組相比，香煙暴露的小鼠肺組織中Rab26的表達降低（圖.2C）。

圖2.香煙暴露抑制了Rab26在體內和體外的表達

DNMT3b調控Rab26的表達

DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase， DNMT）家族成員在介導基因DNA甲基化中起關鍵作用。因此，研究者探索了DNTM3B在香煙暴露誘導的Rab26啟動子DNA甲基化中的作用。研究者發現DNMT3B在香煙暴露小鼠肺組織中的表達增加（圖.3A）。免疫組化分析還顯示，與對照組相比，香煙暴露組氣道上皮DNMT3B水平升高（圖.3B）。

圖3.Rab26抑制香煙暴露誘導的起到上皮細胞炎癥反應

ROS通過調控DNMT3b抑制Rab26的表達

為了確認ROS對Rab26表達的影響及其通過啟動子甲基化的潛在機制，研究者將細胞用不同劑量的H₂O₂（一種ROS）處理2小時。數據顯示H₂O₂增加DNMT3B蛋白的產生，抑制Rab26的表達（圖.4E）。與上述結果一樣，NAC預孵育細胞后，H₂O₂存在下Rab26的下調表達得到部分恢復（圖.4F）。熒光素酶檢測顯示H₂O₂抑制Rab26啟動子的活性（圖.4G）。這些數據表明，香煙暴露誘導的ROS抑制了Rab26啟動子的活性，下調了Rab26的表達，導致炎癥介質的產生。而NAC能部分逆轉香煙暴露對Rab26表達的抑制作用。

圖4.ROS通過調控DNMT3b抑制Rab26的表達

抗氧化劑增強Rab26表達，減輕COPD小鼠的炎癥反應

體外實驗顯示，香煙暴露誘導的氧化劑導致上皮細胞中Rab26的生成減少，炎癥增加，而NAC（N-乙酰半胱胺酸）是目前廣泛應用于治療COPD患者。本研究通過NAC證實抗氧化劑對體內Rab26表達的調節作用，以及提高肺組織中Rab26表達對COPD小鼠炎癥反應的影響。H&E顯示NAC改善了鰓周區域的炎癥細胞浸潤（圖.5A）。圖7B顯示，小鼠在香煙暴露期飲用NAC溶液后，Rab26表達升高，DNMT3b水平下降。同樣，與香煙暴露組相比，NAC/香煙暴露組肺氣道上皮中Rab26表達升高，DNMT3b表達降低（圖.5C）。此外，NAC處理抑制香煙暴露誘導的IL-8和IL-6的BALF水平（圖.5D＆E）。這些數據表明，ROS可能通過促進DNMT3b介導的DNA甲基化和改善香煙暴露誘導的COPD小鼠炎癥反應中Rab26的表達來抑制Rab26。

圖5.抗氧化劑增強了Rab26表達，減輕COPD小鼠的炎癥反應

在構建慢性阻塞性肺疾病（COPD）的動物模型時，玉研儀器精心選擇了一些關鍵的造模參數，以確保模型的準確性和可靠性。

首先，考慮到香煙暴露作為COPD發病的主要因素，因此需設定精確的香煙暴露條件。通過控制香煙煙霧的濃度、暴露頻率和持續時間，可以成功模擬出長期吸煙對肺組織的損害作用。

其次，為了模擬COPD患者肺部炎癥的復雜環境，引入了多種炎癥介質和細胞因子的刺激。這些介質和因子的種類、濃度和作用時間均經過精心調整，以最大程度地模擬COPD患者體內的炎癥反應。

此外，還需注重模擬COPD患者肺部氣流受限的特征。通過調整氣道阻力、肺順應性和通氣功能等參數，可以成功構建具有氣流阻塞特征的COPD模型。

在整個造模過程中，嚴格遵循科學原則，確保實驗數據的準確性和可重復性。同時，研究者還需注重動物福利和倫理原則，確保實驗過程對動物的傷害最小化。

通過這些精心設計的造模參數，可以成功構建能夠真實反映COPD病理生理改變的動物模型，為后續的研究提供了有力的工具：

1、僅用香煙暴露進行小鼠造模：待小鼠適應實驗環境后，被隨機分配到四個組：對照組、PM2.5組、吸煙組和PM2.5+吸煙組，每組有7只小鼠。對照組小鼠僅暴露在室內空氣，無PM2.5。PM2.5組小鼠通過超聲波霧化器吸入PM2.5（濃度為110 μg/m³）。吸煙組小鼠在香煙暴露染毒箱內吸入香煙煙霧（在2.5小時內消耗10支香煙）。PM2.5+吸煙組小鼠同時暴露于PM2.5和香煙煙霧中。暴露方式：所有小鼠每周5天，每天兩次接受上述處理，持續10個月。實驗結束后，小鼠被處死，并收集肺組織進行分析。

2、香煙暴露聯合氣道內滴注脂多糖方法進行造模：持續時間8周，除空白組外，其余各組小鼠置于自動小動物熏煙箱中，將香煙插入自動點煙盒，點燃后打開微型真空泵，將煙霧引入暴露箱體中。每天進行香煙暴露兩次，間隔3小時，每次點煙8支，煙霧最大濃度狀態維持30min。（備注：每次30min熏煙過程中可間隔15min適當通入少量氧氣，警惕小鼠缺氧死亡）熏6天停1天，連續熏煙8周。在第1、14、21天用10%水合氯醛0.3ml/100g對各組小鼠進行腹腔麻醉，后切開頸部皮膚，暴露氣管，空白組予0.2ml生理鹽水氣道內注射，其余各組予濃度為1mg/ml的脂多糖0.2ml氣管注射（注射當日不熏煙）。

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